TCSPC為時域FLIM金標準，相量分析可處理<100光子低計數場景

1 背景與問題

熒光成像已成為研究細胞結構和功能的不可或缺的手段。然而，傳統的基於強度的熒光成像方法容易受到光譜串擾、探針濃度、光源強度波動以及光漂白的影響，導緻定量分析困難。

為了解決這些問題，熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）應運而生。熒光壽命是熒光團激發態動力學的獨特“指紋”，它不依賴於熒光強度，因此能夠提供關於分子微環境、蛋白質相互作用及代謝狀態的精準信息。盡管FLIM技術潛力巨大，但在實際應用中仍面臨諸多挑戰，例如光子效率低、探針靈敏度不足以及在活細胞環境中實現高速成像的困難。此外，為了實現多靶標同時成像和超分辨觀測，對激發光源的穩定性、脈衝寬度以及特定波長（如深紫外）覆蓋範圍提出了極高的要求。

2 核心方案

本綜述文章詳細探討了FLIM技術的最新進展，重點分析了時域（tdFLIM）和頻域（fdFLIM）兩種核心技術。

在時域FLIM中，時間相關單光子計數（TCSPC）被認為是金標準方法。該方法通過記錄脈衝激光激發後光子的到達時間，構建熒光衰減曲線。文章指出，TCSPC結合激光掃描共焦系統，能夠提供卓越的對比度、高靈敏度以及無標記成像能力，已在臨床和基礎生物學研究中展現出巨大潛力。

此外，文章還重點介紹了相量分析方法。與傳統的指數擬合相比，相量方法提供了一種快速且無需模型的替代方案，特別適用於處理多指數衰減和低光子計數（<100光子）的情況，極大地提高了數據分析的效率和魯棒性。

圖1.FLIM原理。時間域（td）和頻率域（fd）模式下熒光壽命數據采集與分析的示意圖。在tdFLIM中，每次脈衝激發後記錄光子到達時間，以構建衰減直方圖，該直方圖可通過多指數曲線擬合進行分析，或轉換至相量空間以實現無模型壽命提取。在fdFLIM通過高頻強度調製測量發射信號，從而獲得相位偏移和解調因子，這些因子同樣可通過擬合或相量分析進行處理。

3 實驗結果與分析

文章通過大量實驗數據展示了FLIM在多色成像和生物傳感中的應用能力。

3.1 熒光蛋白的壽命特征
研究者彙總了不同光譜範圍內的熒光蛋白（FP）的壽命特征。如下表所示，通過工程化改造，熒光蛋白的壽命範圍得到了顯著擴展，這為在同一光譜窗口內利用壽命差異進行多靶標區分提供了基礎。

3.2 定量生物傳感
FLIM被廣泛用於測量FRET效率以及環境敏感參數（如pH、Ca²⁺濃度、NADH狀態）。文章指出，盡管FLIM生物傳感器具有不受探針濃度和光漂白影響的優點，但其動態範圍通常受限（<500 ps變化）。為了分辨這些細微變化，系統需要極高的時間分辨率和光子計數精度。在典型的光子預算（10^4-10^5光子/像素）下，壽命精度被限製在約100–300 ps。

圖2 FLIM生物傳感器。環境傳感FLIM生物傳感器的示意圖（不包括FLIM-FRET）。這些生物傳感器可監測活細胞中的多種細胞參數，包括：1.細胞周期狀態；2.分子擁擠程度；3.細胞膜電位；4.溫度；5.氧化還原狀態（遊離與蛋白質結合的NADH）；6.蛋白質活性；7.離子濃度（如Ca²⁺、H⁺）

3.3 超分辨與多模態集成
文章還探討了FLIM與超分辨技術（如STED、SMLM）的結合。例如，FLIM-STED理論上可以通過壽命差異實現多達8個不同靶標的成像，克服傳統多色STED成像中染料漂白和光毒性大的問題。

4 產品介紹

PLED

皮秒脈衝二極管激光源

PLED是一款280 nm深紫外皮秒半導體光源，用於熒光壽命和時間分辨光譜實驗中的深紫外激發。其主要用於以緊湊、易集成的方式覆蓋常規可見光皮秒光源難以滿足的波長範圍。適用於寬帶隙材料、紫外發光材料、分子躍遷和現有壽命系統擴展。深紫外激發對於寬禁帶材料、紫外發光材料、特定分子躍遷和生物熒光研究具有重要價值，但可用皮秒光源相對有限。PLED以280 nm脈衝輸出擴展TCSPC與時間分辨光譜能力，適合現有壽命系統升級。

4.1 技術特點

(1) 采用皮秒半導體光源架構，可作為TCSPC壽命測量和時間分辨熒光光譜的激發端；

(2) 脈寬達到≤200 ps，重複頻率覆蓋單次觸發至40 MHz，具備穩定外觸發和光纖耦合選件，12 h功率穩定度達到3% RMS級；

(3) 支持與Oriental Spectra、Edinburgh Instruments、HORIBA及PTI等光譜平台配套；

(4) 工作溫度覆蓋-10℃至45℃，存儲溫度覆蓋-25℃至70℃，適合實驗室日常運行與集成。

4.2 產品優勢

(1) 紫外波長可直接激發寬帶隙材料、紫外發光體系及特定分子躍遷，建立明確應用差異；

(2) 相較大型倍頻激光方案，半導體光源更緊湊、維護量低，便於集成到現有壽命系統；

(3) 多品牌光譜儀兼容性使其適合作為深紫外壽命能力擴展模塊，降低整機替換需求；

(4) 深紫外皮秒光源選擇較少，PLED能夠以較低部署複雜度補充寬帶隙與深紫外激發能力。

綜上所述，TCSPC結合相量分析法，在低光子計數（<100光子/像素）場景下仍能穩健提取壽命參數。東譜科技Pina系列皮秒激光器提供375-1550nm多波長、≤200 ps脈寬及80 MHz重複頻率，兼容主流時間分辨系統。PLED 280nm深紫外光源可擴展寬帶隙材料研究波長能力。配合HiLight的TCSPC模塊，可為FLIM數據分析與硬件升級提供全鏈路支持。東譜科技緻力於以高性能光源推動FLIM技術應用。

原文參考：Emerging trends of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM): advances, challenges, and prospects