IRF僅18.9 ps——TCSPC FLIM如何解析黑色素13 ps超快衰減與NAD(P)H亞納秒成分

1 背景與問題

熒光壽命成像（FLIM）技術已超越簡單的顯微成像對比度，成為獲取生物系統分子信息的關鍵手段。然而，在生命科學和臨床應用中，FLIM面臨著嚴峻的技術挑戰。

生物樣本中的熒光衰減通常呈多指數分布，包含結合態與遊離態、FRET效應等複雜成分。為了準確解析這些成分，系統必須具備極高的時間分辨率（皮秒級）和極高的光子效率。此外，在代謝成像（如NADH和FAD檢測）和FRET測量中，激發光源的波長、脈衝寬度和重複頻率直接決定了數據的準確性。傳統的寬場技術雖然速度快，但受限於散射和離焦信號，難以在厚組織或深層成像中獲得高質量的代謝信息。因此，開發高穩定、低抖動、特定波長（如375 nm和405 nm）的皮秒脈衝激發源，對於實現高精度的TCSPC FLIM至關重要。

2 核心方案

該綜述論文深入探討了基於時間相關單光子計數（TCSPC）的FLIM技術，指出其是結合了最高空間分辨率和時間分辨率的分子成像技術。論文重點分析了TCSPC FLIM在解決多指數衰減解析、光學層析能力以及抑製散射方面的優勢。

論文詳細闡述了以下核心技術：

(1) TCSPC FLIM原理：通過記錄每個光子相對於激光脈衝的到達時間，構建光子分布，實現近理想的光子效率和精度；

(2) 多維度TCSPC：支持多波長、激發波長複用以及快速時間序列記錄；

(3) 激發波長複用：在代謝成像中，常需同時使用375 nm（激發NADH）和440 nm（激發FAD）的激光器進行複用掃描；

(4) 高時間分辨率：為了解析黑色素（<10 ps）、FRET供體成分（<400 ps）及NAD(P)H/FAD的快速成分（<300 ps），系統需具備亞20 ps的儀器響應函數（IRF）；

(5) 高重複頻率：為了避免堆積效應並提高采集速度，系統通常運行在80 MHz的高重複頻率下。

圖1.光熒光的激發與發射過程包括：(a)吸收，(b)熒光發射，(c)內轉換，(d)消光，(e)過渡至三重態，以及(f)發生磷光發射。

圖2.通過激光掃描和多維TCSPC獲得的FLIM圖像。

3 實驗結果與分析

論文展示了TCSPC FLIM在多種應用中的卓越性能，特別是在代謝成像和臨床檢測方面。

3.1 關鍵性能指標

時間分辨率：論文展示了使用快速TCSPC系統配合混合探測器，實現了18.9 ps（FWHM）的IRF寬度（見圖19）。這遠超出了分辨生物樣本中快速衰減成分所需的閾值。

代謝成像參數：通過雙指數擬合，能夠準確提取NAD(P)H和FAD的遊離態與結合態壽命及振幅。例如，在腫瘤組織中，NADH的短壽命成分振幅顯著增加，可作為腫瘤標誌物。

FRET測量：利用雙指數衰減分析，可區分相互作用與非相互作用的供體，計算FRET效率及供體-受體距離，且無需外部校準。

3.2 技術對比

論文對比了不同FLIM技術的性能，如下表所示：

圖3.快速TCSPC FLIM系統的IRF。使用飛秒光纖激光器的120飛秒脈衝測量得出。

圖4.TCSPC FLIM圖像。雙指數衰減的平均（振幅加權）壽命。圖像尺寸：715 × 715 μm（1024 × 1024像素）。右側：圖像中選定區域的衰減曲線。藍色圓點表示TCSPC時間通道中的光子數，紅色曲線為擬合到TCSPC數據的模型函數，綠色曲線為IRF（衝激響應函數），IRF寬度為97 ps。

圖5.細胞狀態從正常（氧化磷酸化）到高階腫瘤（糖酵解）時，NADH（a）和FAD（b）的平均（振幅加權）半衰期變化。

4 產品介紹

PLD

皮秒脈衝半導體激光器

PLD是一款375 nm或405 nm皮秒半導體激光器，主要作為TCSPC熒光壽命和時間分辨光譜系統的激發光源。它通過緊湊、可觸發的皮秒脈衝輸出擴展現有光譜儀的壽命測量能力。適用於紫外或藍光激發的熒光壽命、TRPL、單光子計數和系統升級。TCSPC、TRPL和時間分辨顯微系統常需要穩定、可觸發且易於耦合的皮秒激發源。PLD適合紫外與藍光激發熒光壽命測量，也可作為現有Oriental Spectra、Edinburgh Instruments、HORIBA和PTI光譜系統的波長擴展模塊。

4.1 技術特點

(1) 脈寬達到≤70 ps，重複頻率覆蓋單次觸發至40/80 MHz，觸發抖動控製在5 ps級，12 h功率穩定度達到1% RMS級；

(2) 采用皮秒脈衝半導體激光架構，可作為熒光壽命和單光子計數系統激發源；

(3) 支持與Oriental Spectra、Edinburgh Instruments、HORIBA和PTI等光譜平台聯用；

(4) 工作溫度覆蓋-10℃至45℃，適合實驗室連續運行；

(5) 皮秒脈衝輸出與主流時間分辨光譜儀兼容，便於進行同步觸發、光纖耦合和現有系統升級。

4.2 產品優勢

(1) 專用皮秒激發源定位清晰，可用於替代昂貴進口壽命系統配套激光頭；

(2) 多品牌光譜平台兼容性降低用戶現有系統升級和維護成本；

(3) 緊湊半導體激光方案相比大型脈衝激光器更易部署、維護和觸發同步；

(4) 作為兼容型激發模塊，PLD可直接擴展現有壽命系統的波長能力，通常比更換整套光譜儀更經濟。

綜上所述，TCSPC FLIM以亞20 ps的IRF實現了對黑色素（<10 ps）及NAD(P)H亞納秒成分的精準解析。東譜科技PLD皮秒脈衝激光器提供≤70 ps脈寬、40/80 MHz重複頻率及5 ps級抖動，兼容主流光譜平台。HiLight系統支持TCSPC壽命測試（50ps~100μs），可實現對FLIM的精準表征。東譜科技以緊湊、經濟的半導體光源方案，助力生命科學FLIM研究。

原文參考：Fluorescence Lifetime Imaging Techniques—A Review on Principles, Applications and Clinical Relevance