Amide I峰位偏移8 cm⁻¹，顱內動脈瘤壁蛋白質解折疊——532 nm共聚焦拉曼的分子指紋證據

1 背景與問題

顱內動脈瘤是一種腦血管的病理性擴張，影響著全球約2–3%的成年人口。盡管未破裂的動脈瘤通常無症狀，但一旦破裂會導緻蛛網膜下腔出血（SAH），這是一種危及生命的狀況，破裂概率約為每年0.25%。破裂後的死亡率極高，前3個月內約為20%，5年內上升至30%。

目前，未破裂顱內動脈瘤的管理極具挑戰性，臨床醫生必須在破裂風險與手術或血管內幹預的潛在並發症之間進行權衡。傳統的影像學方法如CT和MRI雖然是動脈瘤診斷的標準手段，但它們提供的生化信息非常有限，難以揭示血管壁的微觀結構變化。

動脈瘤的進展與細胞外基質（ECM）的重塑密切相關，特別是膠原蛋白和 彈性蛋白的變化。然而，由於生物機製的複雜性，將動脈瘤發展背後的分子途徑轉化為臨床標誌物一直十分困難。因此，醫學界迫切需要一種能夠無損、高分辨率地探測血管壁分子組成和結構變化的技術，以更準確地評估破裂風險。

2 核心方案

本研究發表於Scientific Reports，采用激光共聚焦拉曼顯微光譜技術，對同一患者的動脈瘤組織和健康基底動脈組織進行了匹配分析。該研究利用拉曼光譜的分子指紋特性，結合高空間分辨率成像，深入探究了顱內動脈瘤壁中的結構和分子變化。

研究的核心測試方法包括：

(1) 532 nm 激光激發：利用單色光的非彈性散射捕獲分子的振動光譜；

(2) 高分辨率成像：在冷凍切片樣品上進行空間分辨率為 1 μm/pixel（動脈瘤組織）和 2 μm/pixel（健康組織）的掃描；

(3) 多變量數據分析：使用非負矩陣分解（NMF）和主成分分析（PCA）處理複雜的光譜數據；

(4) 光譜解卷積：重點分析 Amide I 帶（1600–1700 cm⁻¹），以評估蛋白質的二級結構變化。

圖1.健康動脈壁的H&E染色圖像，其中外膜位於圖像左上角。通過肽鍵結構展示了酰胺I的分子來源，突出了關鍵原子振動貢獻（C=O伸縮和N–H彎曲）。從三個解剖學層——外膜、中層和內膜——分別獲取了平均拉曼光譜，並以酰胺I帶區域（1600–1700 cm⁻¹，左側面板陰影部分）進行二級結構分析。右側面板顯示了各解剖學層對應區域的放大視圖，以及針對每個層次采用雙高斯峰去卷積處理後的結果。與表1的光譜比較表明，該區域存在有序和無序α-螺旋以及平行β-鏈，其相對豐度在不同解剖區域存在差異。在我們的測量中，酰胺I的最大吸收峰出現在略低的波數處（約1600 cm⁻¹）高於典型含水組織的值（約1650 cm⁻1由於固定冷凍切片處於脫水狀態，532 nm的激發波長以及芳香族氨基酸和β-折疊結構模式的重疊貢獻，這些因素並未影響二級結構的測定。值得注意的是，通過酰胺I峰去卷積分析發現，從外膜向內膜方向，α-螺旋和β-折疊結構的相對貢獻呈現漸進變化。在2950 cm⁻1處的CH伸縮振動拉曼強度圖1反映動脈壁中總體蛋白質含量及分布情況。

研究團隊通過對比健康與病變組織的拉曼光譜，成功識別出了膠原蛋白和彈性蛋白的信號強度變化及其空間分布的異常，為動脈瘤壁完整性的評估提供了新的光譜學標誌物。

3 實驗結果與分析

通過對健康和動脈瘤組織的橫截面拉曼成像掃描，研究團隊獲得了關鍵的性能數據和參數，揭示了動脈瘤壁的病理重塑過程。

3.1 蛋白質空間分布的重構；

研究利用True Component Analysis (TCA) 生成了蛋白質特異性分布圖。結果顯示，與健康血管相比，動脈瘤壁中膠原蛋白I、III和彈性蛋白的信號強度顯著降低。

(1) 健康組織：膠原蛋白 I 和 III 呈現出分層結構分布，膠原蛋白 III 在中膜層尤為豐富，彈性蛋白主要位於外膜；

(2) 動脈瘤組織：膠原蛋白 I 和 III 的分布不規則且強度減弱，彈性蛋白顯著耗盡。值得注意的是，網絡形成型膠原蛋白 IV 在中膜區域異常增多，可能是一種代償性反應。

圖2.一對基底動脈-動脈瘤組織的拉曼成像掃描，突顯了細胞外基質的關鍵成分。左側面板顯示健康血管（左），右側面板顯示相應的動脈瘤切片（右）。展示了CH伸長振動的光譜分布圖（2950 cm⁻¹）。以及Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原蛋白和彈性蛋白。瘤樣組織中所有結構蛋白的信號強度均降低，尤其是膠原蛋白和彈性蛋白，表明結締組織基質（ECM）已發生嚴重退化，並喪失了動脈的彈性。光譜差異證實了與動脈瘤相關的膠原蛋白降解和彈性蛋白減少。對平均拉曼光譜進行比較後發現，主要二級結構發生了變化：健康血管壁以β-螺旋相關信號（1671 cm⁻¹）為特征，而瘤樣區域則顯示出無序α-螺旋成分增加（峰位在1636 cm⁻¹），提示病變血管中的蛋白質已發生折疊和構象改變。

3.2 蛋白質二級結構的改變；

Amide I 峰的解卷積分析揭示了蛋白質構象的深刻變化。健康組織以有序的β-折疊結構為主，而動脈瘤組織則顯示出向α-螺旋和無規卷曲結構的轉變。

圖5. (a)健康（VE，紅色）和病變（AN，藍色）組織的平均拉曼光譜中酰胺I峰區域的去卷積。各譜圖由所有有效掃描數據的平均值生成，並對每種組織狀態（健康=VE+VEC，動脈瘤=AN+ANC）的合並譜圖進行酰胺I峰去卷積，顯示從1583/1611/1673 cm⁻處的位移1（健康）至1591/1635/1669 cm⁻1（動脈瘤）。由此產生的峰圖顯示了蛋白質二級結構的明顯差異。（b）主成分分析：基於650至1700 cm⁻¹範圍內的光譜數據，繪製主成分2（PC2）與PC3的關系圖。在PC2上清晰的聚類表明，健康組織（VE，紅色，負相關）與動脈瘤組織（AN，藍色，正相關）分離開來，提示其具有不同的生化特征（VE=原發患者健康血管；AN=原發患者動脈瘤組織；VEC=對照患者健康血管；ANC=對照患者動脈瘤組織）。（c）對應的PC2載荷圖，顯示各組織類型特有的峰，可識別出健康組織（VE，紅色，負相關）和病變組織（AN，藍色，正相關）。在1091 cm⁻¹處的峰（碳-氧伸縮鍵在碳水化合物/糖蛋白和磷酸二酯鍵中的伸展）以及1507 cm⁻1（苯丙氨酸和色氨酸側鏈中的芳香族C=C伸縮振動）是健康組織的特征性表現。動脈瘤組織中出現的陽性載荷對應於膠原蛋白降解產物以及二級結構的改變。

3.3 PCA 分析結果；

主成分分析（PCA）在指紋區（600-1800 cm⁻¹）成功分離了健康和動脈瘤組織的光譜。PC2清楚地將健康組織（負相關）與動脈瘤組織（正相關）區分開來，表明兩者具有截然不同的生化特征。這種分離能力證明了拉曼光譜在檢測細胞外基質細微變化方面的高靈敏度。

4 產品介紹

MREPET 300

激光共聚焦拉曼光譜儀

MREPET 300是一款激光共聚焦拉曼光譜與三維成像平台，用於非破壞性分析材料的化學組分、相態結構、應力和空間分布。系統將共聚焦顯微、多激光激發、低波數拉曼和XYZ掃描集成。適用於無機材料、有機材料、半導體、生物材料和微區缺陷分析。二維材料、半導體、微塑料、電池材料和生物樣品研究廣泛使用共聚焦拉曼進行無損化學成像。MREPET 300 b適合應力/應變mapping、相態識別、低波數晶格振動、缺陷定位和三維組分分布分析。

4.1 技術特點

(1) 共聚焦光路實現橫向0.5-1 μm、Z軸1-2 μm級空間分辨，並有效抑製焦外雜散光；

(2) 穩定實現10 cm⁻¹低波數、≤0.5 cm⁻¹光譜分辨率、≤0.5 μm橫向空間分辨率和8 h激光功率穩定度<1% RMS；

(3) 采用-70℃背照式深製冷CCD，支持低波數拉曼檢測及弱信號測量；

(4) 支持532 nm、633 nm、785 nm及紫外激光等多波長配置與一鍵切換，適配不同熒光背景和共振條件；

(5) 高精度XYZ掃描可構建三維化學成分分布圖，並可擴展拉曼-熒光聯用；

(6) 多激光與高精度XYZ掃描可根據熒光背景、共振條件和樣品尺度選擇測量配置，並生成二維/三維拉曼圖。

4.2 產品優勢

(1) 共聚焦三維化學成像同時提供分子指紋和空間分布，區別於單點拉曼或普通顯微光譜；

(2) 多激光與低波數能力提高對複雜材料、晶格振動和熒光幹擾樣品的適配性；

(3) 自動校準與聯用擴展兼顧數據重複性和研究深度，適合作為材料微區分析核心平台；

(4) 低波數、多激光與三維化學成像組合，使其既能做材料指紋識別，還能處理應力、相態和空間分布問題。

利用532 nm共聚焦拉曼光譜捕獲動脈瘤組織Amide I峰位向1636 cm⁻¹偏移8 cm⁻¹的特征信號，結合PCA分析揭示膠原蛋白降解及蛋白質二級結構由β-折疊向無序α-螺旋轉變的分子指紋。東譜科技MREPET 300激光共聚焦拉曼光譜儀，集成共聚焦三維化學成像與多波長激發，將論文中動脈瘤壁分子指紋識別能力轉化為生物組織病理研究與材料微區分析的通用平台，為疾病分子機製探索提供有力支撐。

原文參考：Confocal Raman microspectroscopy imaging reveals structural protein reorganization in human intracranial aneurysm tissue