日常生活中，我們看的超清電視，電腦屏幕，照相機拍的照片，都有像素一說，比如1024×1024，像素越高，表示圖像質量越接近於原始圖像。如果把低像素的圖片放大到一定程度，圖片會非常模糊，類似於馬賽克的情況。

圖1 像素較低的圖片

上面說的圖像都是經過機器或者系統得到的圖片，那麼問題來了，如果直接用人眼觀察某一個物體，會出現上面類似馬賽克的情況嗎？答案是也會，雖然非常非常小（納米量級），這就是我們常說的衍射極限。所謂衍射極限就是，由於光的衍射特性，一個物點發出的光會形成一個彌散斑（也稱艾裏斑），當二個物點靠近的時候，達到一定程度就不能再區分開來，通常我們把200 nm稱為分辨率極限。

圖2 衍射極限（圖片來源於網絡）

那麼衍射極限的大小（即分辨率的大小）又是由誰決定的呢？現在我們來看看衍射極限的公式（本來我是極不情願在科普文章裏面寫公式的，霍金曾說過，加一個公式就會少一半的讀者，好吧，為了看清兩者之間的關系，最後還是決定加上）：

                                     （1）

式中δ表示顯微鏡可分別的最小刻度，λ表示光的波長，NA表示顯微鏡的數值孔徑，一般不會超過2。顯而易見，分辨率的大小與波長λ成正比，波長越小，說明能看清的最小刻度越小。比如，藍光的波長比紅光要小，所以相對應藍光的最小分辨率要優於紅光。可以想到，既然波長決定了分辨率的極限，那用更小的波長不就好了，比如紫外光、X射線甚至γ射線（電磁波波長分布見第3講：詳解電磁輻射），這回答沒有毛病，但是波長越短能量越強，會對被觀察的物體產生損傷，尤其是活細胞，這自然是我們不願意看到的。那麼問題又來了，有沒有波長又很短，但是能量卻不強，不會對觀測目標造成傷害的？回答是：還真有，電子顯微鏡。電子顯微鏡采用的是電子束，而不是可見光，一般可見光波長範圍在300~750 nm，但是電子束的波長當加速電壓為50～100 kV時，可以達到0.0053～0.0037 nm。所以，電子顯微鏡的分辨率可達到0.1~0.2 nm，遠優於可見光的200 nm。別高興得太早，凡是有利必有弊，電子顯微鏡的樣本必須在真空環境中才能夠被觀察，so活細胞之類的都不行，應用局限性太大。
      看到這裏，各位看官不要著急，我們肯定有辦法能夠超過衍射極限的。當然，之前的討論也不是沒有用處的，至少讓我們明確一點，衍射極限並不是目標物體天然存在著分辨率極限，而是我們還沒有這個水平看得更細、更清楚。那麼在介紹超分辨技術之前，先來一探為什麼我們不能看得更細的物理本質吧！

------------------------------------------華麗的分割線，前方高能，請注意---------------------------------------

物理本質

前面提到，由於光的物理特性（衍射特性）的存在，導緻點光源形成艾裏斑，重疊以後就難以分辨。這一衍射特性本質上來源於量子光學裏的不確定性原理（即海森堡的測不準原理）。不確定性原理表示，你不可能同時知道粒子的位置和速度（動量），動量不確定性越小，位置不確定度越大，反之亦然。換句話說，當一個光子在某個方向的動量範圍確定的情況下，其分辨率也就確定下來了。根據光子動量的公式p=h/λ，波長λ越小，動量不確定度Δp越大，那就意味著位置不確定度越小，分辨率就越高，其實與公式（1）相吻合。
      然後我們再從傅裏葉理論的角度來分析解釋下：學攝影或者圖像處理的都知道，攜帶物體信息的光波，高頻部分代表細節，低頻部分代表輪廓。那如果我們分辨不出圖像的細節，隻能說明物體高頻部分的信息丟失了。為什麼呢？由於光有很寬的頻譜範圍，而光頻率的較高部分，當滿足一定的相位匹配條件，會形成倏逝波，而倏逝波的特點是光的幅值在垂直深度方向指數衰減，這意味著物體含有高頻部分的光走了波長量級的路程後就衰減沒了，隻有低頻部分的光到達成像面，因此導緻信息（細節部分）的丟失。
      而關於上面加黑的那句話“高頻部分代表細節，低頻部分代表輪廓”有人可能不太理解，那麼我們再引入點擴展函數和傅裏葉理論融會貫通。
      點擴展函數是以空間頻率為變量傳遞的像的調製度和相移的函數。顧名思義，點擴展函數從頻域上來說是以頻率為變量，而時域上是如圖2的脈衝圖像。接下來，我們再來看看傅裏葉級數的變化吧。
      如圖3所示，（a）圖是N=1，表示頻率ω的正弦函數，（b）圖表示頻率ω和頻率3ω的疊加，（c）表示頻率ω、頻率3ω、頻率5ω、頻率7ω的疊加，（d）表示10個不同頻率的疊加。顯然，當高頻率疊加得越多，疊加後的時域圖形越接近於矩形（其實脈衝上升沿的斜率就代表著細節高頻成分的多少）。想象一下，如果如圖2的點光源，時域脈衝是一個矩形的樣子，而不是一個高斯線型，那麼分辨率還會因為艾裏斑疊加而看不清嗎？當然，這隻是一個非常理想的願望，永遠也不可能實現，例如現在的激光器追求的光束質量品質因子就是這樣，要求盡量小的光束發散角，但永遠也不可能不發散。

圖3 傅裏葉級數（圖片來源於知乎，作者 Heinrich）

----------------------------------------------------華麗的分割線------------------------------------------------

超分辨技術

前面提到由於倏逝波的原因，高頻部分的光隻能傳播波長量級的距離就衰減了，導緻細節部分丟失，分辨率最高一般隻能在200 nm左右。那如果要實現超分辨的第一個辦法就是：乘它還沒衰減之前就成像。這就是傳說中的近場成像，近場成像自然不受傳統的衍射極限的限製，分辨率能夠高達納米量級，但是在應用上存在同樣的問題，如此貼近距離的測量，一則肯定不利於活細胞的觀測，二則視場被限製得很厲害，存在畸變失真。
      那麼相對於近場成像，另外一個就顯而易見了，遠場成像。通常，我們所說的光學顯微鏡的超分辨成像技術指的就是遠場成像，2014年諾貝爾化學獎授予了美國及德國三位科學家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner，以表彰他們在遠場超分辨成像技術領域取得的成績。
      遠場超分辨成像技術可以分為兩類：一類是基於單分子定位技術的超分辨顯微成像方法，包括光激活定位顯微技術(PALM)和隨機光學重構顯微技術(STORM)；另一類是基於點擴展函數調製的超分辨顯微成像方法，包括受激發射損耗顯微技術(STED)和結構照明顯微技術(SIM)。植入廣告：期刊《光學學報》於2017年3月份出版一期“超分辨成像”專題，如有興趣的童鞋敬請關注。
      第一類，基於單分子定位的超分辨技術，其基本原理是：通過技術手段標記細胞的蛋白質，然後利用激光器低能量照射細胞表面，激活稀疏分布的幾個熒光分子進行定位，再重複上百次，然後擬合這些圖像到一張圖上，從而得到分辨率提到10倍以上的定位精度。這類技術從本質上來說並沒有縮小點擴展函數，而是通過犧牲時間分辨率，從而來提高空間分辨率。圖4是隨機光學重構顯微技術(STORM)的發明者美國霍華德-休斯頓研究所華裔科學家莊曉薇。

圖4 美國華裔科學家莊曉薇（圖片來源於網絡）

第二類，基於點擴展函數調製的超分辨技術。這一類是真正從源頭上提高了圖像的分辨率。例如，2014年諾貝爾化學獎的受激發射損耗顯微技術(STED)原理如下：通過添加一路激光（圖5（a）），讓這路激光和原先的激光艾裏斑疊加（圖5（b）），但是新添加的激光光斑會有效抑製艾裏斑邊沿區域的激發態熒光分子發光（圖5（c）），從而大大減小了光源的點擴展函數的半高寬，分辨率極限可以達到16 nm。

圖5 STED原理圖（圖片來源於網絡）

超分辨技術，尤其是遠場超分辨成像技術越來越多地應用在生活當中，在生物醫學方面，除了靜態樣品的觀測外，活體細胞等樣品的觀測也越來越成熟，其他例如精細微結構的光刻、微納加工等領域也都有著重要的應用。相信隨著超分辨成像技術的進一步發展，我們的世界會更加精細。