Amide I峰位偏移8 cm⁻¹，颅内动脉瘤壁蛋白质解折叠——532 nm共聚焦拉曼的分子指纹证据

1 背景与问题

颅内动脉瘤是一种脑血管的病理性扩张，影响着全球约2–3%的成年人口。尽管未破裂的动脉瘤通常无症状，但一旦破裂会导致蛛网膜下腔出血（SAH），这是一种危及生命的状况，破裂概率约为每年0.25%。破裂后的死亡率极高，前3个月内约为20%，5年内上升至30%。

目前，未破裂颅内动脉瘤的管理极具挑战性，临床医生必须在破裂风险与手术或血管内干预的潜在并发症之间进行权衡。传统的影像学方法如CT和MRI虽然是动脉瘤诊断的标准手段，但它们提供的生化信息非常有限，难以揭示血管壁的微观结构变化。

动脉瘤的进展与细胞外基质（ECM）的重塑密切相关，特别是胶原蛋白和 弹性蛋白的变化。然而，由于生物机制的复杂性，将动脉瘤发展背后的分子途径转化为临床标志物一直十分困难。因此，医学界迫切需要一种能够无损、高分辨率地探测血管壁分子组成和结构变化的技术，以更准确地评估破裂风险。

2 核心方案

本研究发表于Scientific Reports，采用激光共聚焦拉曼显微光谱技术，对同一患者的动脉瘤组织和健康基底动脉组织进行了匹配分析。该研究利用拉曼光谱的分子指纹特性，结合高空间分辨率成像，深入探究了颅内动脉瘤壁中的结构和分子变化。

研究的核心测试方法包括：

(1) 532 nm 激光激发：利用单色光的非弹性散射捕获分子的振动光谱；

(2) 高分辨率成像：在冷冻切片样品上进行空间分辨率为 1 μm/pixel（动脉瘤组织）和 2 μm/pixel（健康组织）的扫描；

(3) 多变量数据分析：使用非负矩阵分解（NMF）和主成分分析（PCA）处理复杂的光谱数据；

(4) 光谱解卷积：重点分析 Amide I 带（1600–1700 cm⁻¹），以评估蛋白质的二级结构变化。

图1.健康动脉壁的H&E染色图像，其中外膜位于图像左上角。通过肽键结构展示了酰胺I的分子来源，突出了关键原子振动贡献（C=O伸缩和N–H弯曲）。从三个解剖学层——外膜、中层和内膜——分别获取了平均拉曼光谱，并以酰胺I带区域（1600–1700 cm⁻¹，左侧面板阴影部分）进行二级结构分析。右侧面板显示了各解剖学层对应区域的放大视图，以及针对每个层次采用双高斯峰去卷积处理后的结果。与表1的光谱比较表明，该区域存在有序和无序α-螺旋以及平行β-链，其相对丰度在不同解剖区域存在差异。在我们的测量中，酰胺I的最大吸收峰出现在略低的波数处（约1600 cm⁻¹）高于典型含水组织的值（约1650 cm⁻1由于固定冷冻切片处于脱水状态，532 nm的激发波长以及芳香族氨基酸和β-折叠结构模式的重叠贡献，这些因素并未影响二级结构的测定。值得注意的是，通过酰胺I峰去卷积分析发现，从外膜向内膜方向，α-螺旋和β-折叠结构的相对贡献呈现渐进变化。在2950 cm⁻1处的CH伸缩振动拉曼强度图1反映动脉壁中总体蛋白质含量及分布情况。

研究团队通过对比健康与病变组织的拉曼光谱，成功识别出了胶原蛋白和弹性蛋白的信号强度变化及其空间分布的异常，为动脉瘤壁完整性的评估提供了新的光谱学标志物。

3 实验结果与分析

通过对健康和动脉瘤组织的横截面拉曼成像扫描，研究团队获得了关键的性能数据和参数，揭示了动脉瘤壁的病理重塑过程。

3.1 蛋白质空间分布的重构；

研究利用True Component Analysis (TCA) 生成了蛋白质特异性分布图。结果显示，与健康血管相比，动脉瘤壁中胶原蛋白I、III和弹性蛋白的信号强度显著降低。

(1) 健康组织：胶原蛋白 I 和 III 呈现出分层结构分布，胶原蛋白 III 在中膜层尤为丰富，弹性蛋白主要位于外膜；

(2) 动脉瘤组织：胶原蛋白 I 和 III 的分布不规则且强度减弱，弹性蛋白显著耗尽。值得注意的是，网络形成型胶原蛋白 IV 在中膜区域异常增多，可能是一种代偿性反应。

图2.一对基底动脉-动脉瘤组织的拉曼成像扫描，突显了细胞外基质的关键成分。左侧面板显示健康血管（左），右侧面板显示相应的动脉瘤切片（右）。展示了CH伸长振动的光谱分布图（2950 cm⁻¹）。以及Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原蛋白和弹性蛋白。瘤样组织中所有结构蛋白的信号强度均降低，尤其是胶原蛋白和弹性蛋白，表明结缔组织基质（ECM）已发生严重退化，并丧失了动脉的弹性。光谱差异证实了与动脉瘤相关的胶原蛋白降解和弹性蛋白减少。对平均拉曼光谱进行比较后发现，主要二级结构发生了变化：健康血管壁以β-螺旋相关信号（1671 cm⁻¹）为特征，而瘤样区域则显示出无序α-螺旋成分增加（峰位在1636 cm⁻¹），提示病变血管中的蛋白质已发生折叠和构象改变。

3.2 蛋白质二级结构的改变；

Amide I 峰的解卷积分析揭示了蛋白质构象的深刻变化。健康组织以有序的β-折叠结构为主，而动脉瘤组织则显示出向α-螺旋和无规卷曲结构的转变。

图5. (a)健康（VE，红色）和病变（AN，蓝色）组织的平均拉曼光谱中酰胺I峰区域的去卷积。各谱图由所有有效扫描数据的平均值生成，并对每种组织状态（健康=VE+VEC，动脉瘤=AN+ANC）的合并谱图进行酰胺I峰去卷积，显示从1583/1611/1673 cm⁻处的位移1（健康）至1591/1635/1669 cm⁻1（动脉瘤）。由此产生的峰图显示了蛋白质二级结构的明显差异。（b）主成分分析：基于650至1700 cm⁻¹范围内的光谱数据，绘制主成分2（PC2）与PC3的关系图。在PC2上清晰的聚类表明，健康组织（VE，红色，负相关）与动脉瘤组织（AN，蓝色，正相关）分离开来，提示其具有不同的生化特征（VE=原发患者健康血管；AN=原发患者动脉瘤组织；VEC=对照患者健康血管；ANC=对照患者动脉瘤组织）。（c）对应的PC2载荷图，显示各组织类型特有的峰，可识别出健康组织（VE，红色，负相关）和病变组织（AN，蓝色，正相关）。在1091 cm⁻¹处的峰（碳-氧伸缩键在碳水化合物/糖蛋白和磷酸二酯键中的伸展）以及1507 cm⁻1（苯丙氨酸和色氨酸侧链中的芳香族C=C伸缩振动）是健康组织的特征性表现。动脉瘤组织中出现的阳性载荷对应于胶原蛋白降解产物以及二级结构的改变。

3.3 PCA 分析结果；

主成分分析（PCA）在指纹区（600-1800 cm⁻¹）成功分离了健康和动脉瘤组织的光谱。PC2清楚地将健康组织（负相关）与动脉瘤组织（正相关）区分开来，表明两者具有截然不同的生化特征。这种分离能力证明了拉曼光谱在检测细胞外基质细微变化方面的高灵敏度。

4 产品介绍

MREPET 300

激光共聚焦拉曼光谱仪

MREPET 300是一款激光共聚焦拉曼光谱与三维成像平台，用于非破坏性分析材料的化学组分、相态结构、应力和空间分布。系统将共聚焦显微、多激光激发、低波数拉曼和XYZ扫描集成。适用于无机材料、有机材料、半导体、生物材料和微区缺陷分析。二维材料、半导体、微塑料、电池材料和生物样品研究广泛使用共聚焦拉曼进行无损化学成像。MREPET 300 b适合应力/应变mapping、相态识别、低波数晶格振动、缺陷定位和三维组分分布分析。

4.1 技术特点

(1) 共聚焦光路实现横向0.5-1 μm、Z轴1-2 μm级空间分辨，并有效抑制焦外杂散光；

(2) 稳定实现10 cm⁻¹低波数、≤0.5 cm⁻¹光谱分辨率、≤0.5 μm横向空间分辨率和8 h激光功率稳定度<1% RMS；

(3) 采用-70℃背照式深制冷CCD，支持低波数拉曼检测及弱信号测量；

(4) 支持532 nm、633 nm、785 nm及紫外激光等多波长配置与一键切换，适配不同荧光背景和共振条件；

(5) 高精度XYZ扫描可构建三维化学成分分布图，并可扩展拉曼-荧光联用；

(6) 多激光与高精度XYZ扫描可根据荧光背景、共振条件和样品尺度选择测量配置，并生成二维/三维拉曼图。

4.2 产品优势

(1) 共聚焦三维化学成像同时提供分子指纹和空间分布，区别于单点拉曼或普通显微光谱；

(2) 多激光与低波数能力提高对复杂材料、晶格振动和荧光干扰样品的适配性；

(3) 自动校准与联用扩展兼顾数据重复性和研究深度，适合作为材料微区分析核心平台；

(4) 低波数、多激光与三维化学成像组合，使其既能做材料指纹识别，还能处理应力、相态和空间分布问题。

利用532 nm共聚焦拉曼光谱捕获动脉瘤组织Amide I峰位向1636 cm⁻¹偏移8 cm⁻¹的特征信号，结合PCA分析揭示胶原蛋白降解及蛋白质二级结构由β-折叠向无序α-螺旋转变的分子指纹。东谱科技MREPET 300激光共聚焦拉曼光谱仪，集成共聚焦三维化学成像与多波长激发，将论文中动脉瘤壁分子指纹识别能力转化为生物组织病理研究与材料微区分析的通用平台，为疾病分子机制探索提供有力支撑。

原文参考：Confocal Raman microspectroscopy imaging reveals structural protein reorganization in human intracranial aneurysm tissue