TCSPC为时域FLIM金标准，相量分析可处理<100光子低计数场景

1 背景与问题

荧光成像已成为研究细胞结构和功能的不可或缺的手段。然而，传统的基于强度的荧光成像方法容易受到光谱串扰、探针浓度、光源强度波动以及光漂白的影响，导致定量分析困难。

为了解决这些问题，荧光寿命成像显微镜（FLIM）应运而生。荧光寿命是荧光团激发态动力学的独特“指纹”，它不依赖于荧光强度，因此能够提供关于分子微环境、蛋白质相互作用及代谢状态的精准信息。尽管FLIM技术潜力巨大，但在实际应用中仍面临诸多挑战，例如光子效率低、探针灵敏度不足以及在活细胞环境中实现高速成像的困难。此外，为了实现多靶标同时成像和超分辨观测，对激发光源的稳定性、脉冲宽度以及特定波长（如深紫外）覆盖范围提出了极高的要求。

2 核心方案

本综述文章详细探讨了FLIM技术的最新进展，重点分析了时域（tdFLIM）和频域（fdFLIM）两种核心技术。

在时域FLIM中，时间相关单光子计数（TCSPC）被认为是金标准方法。该方法通过记录脉冲激光激发后光子的到达时间，构建荧光衰减曲线。文章指出，TCSPC结合激光扫描共焦系统，能够提供卓越的对比度、高灵敏度以及无标记成像能力，已在临床和基础生物学研究中展现出巨大潜力。

此外，文章还重点介绍了相量分析方法。与传统的指数拟合相比，相量方法提供了一种快速且无需模型的替代方案，特别适用于处理多指数衰减和低光子计数（<100光子）的情况，极大地提高了数据分析的效率和鲁棒性。

图1.FLIM原理。时间域（td）和频率域（fd）模式下荧光寿命数据采集与分析的示意图。在tdFLIM中，每次脉冲激发后记录光子到达时间，以构建衰减直方图，该直方图可通过多指数曲线拟合进行分析，或转换至相量空间以实现无模型寿命提取。在fdFLIM通过高频强度调制测量发射信号，从而获得相位偏移和解调因子，这些因子同样可通过拟合或相量分析进行处理。

3 实验结果与分析

文章通过大量实验数据展示了FLIM在多色成像和生物传感中的应用能力。

3.1 荧光蛋白的寿命特征
研究者汇总了不同光谱范围内的荧光蛋白（FP）的寿命特征。如下表所示，通过工程化改造，荧光蛋白的寿命范围得到了显著扩展，这为在同一光谱窗口内利用寿命差异进行多靶标区分提供了基础。

3.2 定量生物传感
FLIM被广泛用于测量FRET效率以及环境敏感参数（如pH、Ca²⁺浓度、NADH状态）。文章指出，尽管FLIM生物传感器具有不受探针浓度和光漂白影响的优点，但其动态范围通常受限（<500 ps变化）。为了分辨这些细微变化，系统需要极高的时间分辨率和光子计数精度。在典型的光子预算（10^4-10^5光子/像素）下，寿命精度被限制在约100–300 ps。

图2 FLIM生物传感器。环境传感FLIM生物传感器的示意图（不包括FLIM-FRET）。这些生物传感器可监测活细胞中的多种细胞参数，包括：1.细胞周期状态；2.分子拥挤程度；3.细胞膜电位；4.温度；5.氧化还原状态（游离与蛋白质结合的NADH）；6.蛋白质活性；7.离子浓度（如Ca²⁺、H⁺）

3.3 超分辨与多模态集成
文章还探讨了FLIM与超分辨技术（如STED、SMLM）的结合。例如，FLIM-STED理论上可以通过寿命差异实现多达8个不同靶标的成像，克服传统多色STED成像中染料漂白和光毒性大的问题。

4 产品介绍

PLED

皮秒脉冲二极管激光源

PLED是一款280 nm深紫外皮秒半导体光源，用于荧光寿命和时间分辨光谱实验中的深紫外激发。其主要用于以紧凑、易集成的方式覆盖常规可见光皮秒光源难以满足的波长范围。适用于宽带隙材料、紫外发光材料、分子跃迁和现有寿命系统扩展。深紫外激发对于宽禁带材料、紫外发光材料、特定分子跃迁和生物荧光研究具有重要价值，但可用皮秒光源相对有限。PLED以280 nm脉冲输出扩展TCSPC与时间分辨光谱能力，适合现有寿命系统升级。

4.1 技术特点

(1) 采用皮秒半导体光源架构，可作为TCSPC寿命测量和时间分辨荧光光谱的激发端；

(2) 脉宽达到≤200 ps，重复频率覆盖单次触发至40 MHz，具备稳定外触发和光纤耦合选件，12 h功率稳定度达到3% RMS级；

(3) 支持与Oriental Spectra、Edinburgh Instruments、HORIBA及PTI等光谱平台配套；

(4) 工作温度覆盖-10℃至45℃，存储温度覆盖-25℃至70℃，适合实验室日常运行与集成。

4.2 产品优势

(1) 紫外波长可直接激发宽带隙材料、紫外发光体系及特定分子跃迁，建立明确应用差异；

(2) 相较大型倍频激光方案，半导体光源更紧凑、维护量低，便于集成到现有寿命系统；

(3) 多品牌光谱仪兼容性使其适合作为深紫外寿命能力扩展模块，降低整机替换需求；

(4) 深紫外皮秒光源选择较少，PLED能够以较低部署复杂度补充宽带隙与深紫外激发能力。

综上所述，TCSPC结合相量分析法，在低光子计数（<100光子/像素）场景下仍能稳健提取寿命参数。东谱科技Pina系列皮秒激光器提供375-1550nm多波长、≤200 ps脉宽及80 MHz重复频率，兼容主流时间分辨系统。PLED 280nm深紫外光源可扩展宽带隙材料研究波长能力。配合HiLight的TCSPC模块，可为FLIM数据分析与硬件升级提供全链路支持。东谱科技致力于以高性能光源推动FLIM技术应用。

原文参考：Emerging trends of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM): advances, challenges, and prospects