IRF仅18.9 ps——TCSPC FLIM如何解析黑色素13 ps超快衰减与NAD(P)H亚纳秒成分

1 背景与问题

荧光寿命成像（FLIM）技术已超越简单的显微成像对比度，成为获取生物系统分子信息的关键手段。然而，在生命科学和临床应用中，FLIM面临着严峻的技术挑战。

生物样本中的荧光衰减通常呈多指数分布，包含结合态与游离态、FRET效应等复杂成分。为了准确解析这些成分，系统必须具备极高的时间分辨率（皮秒级）和极高的光子效率。此外，在代谢成像（如NADH和FAD检测）和FRET测量中，激发光源的波长、脉冲宽度和重复频率直接决定了数据的准确性。传统的宽场技术虽然速度快，但受限于散射和离焦信号，难以在厚组织或深层成像中获得高质量的代谢信息。因此，开发高稳定、低抖动、特定波长（如375 nm和405 nm）的皮秒脉冲激发源，对于实现高精度的TCSPC FLIM至关重要。

2 核心方案

该综述论文深入探讨了基于时间相关单光子计数（TCSPC）的FLIM技术，指出其是结合了最高空间分辨率和时间分辨率的分子成像技术。论文重点分析了TCSPC FLIM在解决多指数衰减解析、光学层析能力以及抑制散射方面的优势。

论文详细阐述了以下核心技术：

(1) TCSPC FLIM原理：通过记录每个光子相对于激光脉冲的到达时间，构建光子分布，实现近理想的光子效率和精度；

(2) 多维度TCSPC：支持多波长、激发波长复用以及快速时间序列记录；

(3) 激发波长复用：在代谢成像中，常需同时使用375 nm（激发NADH）和440 nm（激发FAD）的激光器进行复用扫描；

(4) 高时间分辨率：为了解析黑色素（<10 ps）、FRET供体成分（<400 ps）及NAD(P)H/FAD的快速成分（<300 ps），系统需具备亚20 ps的仪器响应函数（IRF）；

(5) 高重复频率：为了避免堆积效应并提高采集速度，系统通常运行在80 MHz的高重复频率下。

图1.光荧光的激发与发射过程包括：(a)吸收，(b)荧光发射，(c)内转换，(d)消光，(e)过渡至三重态，以及(f)发生磷光发射。

图2.通过激光扫描和多维TCSPC获得的FLIM图像。

3 实验结果与分析

论文展示了TCSPC FLIM在多种应用中的卓越性能，特别是在代谢成像和临床检测方面。

3.1 关键性能指标

时间分辨率：论文展示了使用快速TCSPC系统配合混合探测器，实现了18.9 ps（FWHM）的IRF宽度（见图19）。这远超出了分辨生物样本中快速衰减成分所需的阈值。

代谢成像参数：通过双指数拟合，能够准确提取NAD(P)H和FAD的游离态与结合态寿命及振幅。例如，在肿瘤组织中，NADH的短寿命成分振幅显著增加，可作为肿瘤标志物。

FRET测量：利用双指数衰减分析，可区分相互作用与非相互作用的供体，计算FRET效率及供体-受体距离，且无需外部校准。

3.2 技术对比

论文对比了不同FLIM技术的性能，如下表所示：

图3.快速TCSPC FLIM系统的IRF。使用飞秒光纤激光器的120飞秒脉冲测量得出。

图4.TCSPC FLIM图像。双指数衰减的平均（振幅加权）寿命。图像尺寸：715 × 715 μm（1024 × 1024像素）。右侧：图像中选定区域的衰减曲线。蓝色圆点表示TCSPC时间通道中的光子数，红色曲线为拟合到TCSPC数据的模型函数，绿色曲线为IRF（冲激响应函数），IRF宽度为97 ps。

图5.细胞状态从正常（氧化磷酸化）到高阶肿瘤（糖酵解）时，NADH（a）和FAD（b）的平均（振幅加权）半衰期变化。

4 产品介绍

PLD

皮秒脉冲半导体激光器

PLD是一款375 nm或405 nm皮秒半导体激光器，主要作为TCSPC荧光寿命和时间分辨光谱系统的激发光源。它通过紧凑、可触发的皮秒脉冲输出扩展现有光谱仪的寿命测量能力。适用于紫外或蓝光激发的荧光寿命、TRPL、单光子计数和系统升级。TCSPC、TRPL和时间分辨显微系统常需要稳定、可触发且易于耦合的皮秒激发源。PLD适合紫外与蓝光激发荧光寿命测量，也可作为现有Oriental Spectra、Edinburgh Instruments、HORIBA和PTI光谱系统的波长扩展模块。

4.1 技术特点

(1) 脉宽达到≤70 ps，重复频率覆盖单次触发至40/80 MHz，触发抖动控制在5 ps级，12 h功率稳定度达到1% RMS级；

(2) 采用皮秒脉冲半导体激光架构，可作为荧光寿命和单光子计数系统激发源；

(3) 支持与Oriental Spectra、Edinburgh Instruments、HORIBA和PTI等光谱平台联用；

(4) 工作温度覆盖-10℃至45℃，适合实验室连续运行；

(5) 皮秒脉冲输出与主流时间分辨光谱仪兼容，便于进行同步触发、光纤耦合和现有系统升级。

4.2 产品优势

(1) 专用皮秒激发源定位清晰，可用于替代昂贵进口寿命系统配套激光头；

(2) 多品牌光谱平台兼容性降低用户现有系统升级和维护成本；

(3) 紧凑半导体激光方案相比大型脉冲激光器更易部署、维护和触发同步；

(4) 作为兼容型激发模块，PLD可直接扩展现有寿命系统的波长能力，通常比更换整套光谱仪更经济。

原文参考：Fluorescence Lifetime Imaging Techniques—A Review on Principles, Applications and Clinical Relevance